Covance est désormais Labcorp Drug Development

Nous sommes une seule et même entreprise qui innove pour des millions de personnes. Ensemble, nous continuons à vous proposer des innovations médicales toujours plus avancées.

En savoir plus

Fixation des protéines

Nous contacter

la conformité réglementaire

Des méthodes diverses

Analyses d'efficacité et de sécurité

Après l'entrée et l'apparition d'un médicament dans la circulation systémique, seule la fraction libre et non liée est capable d'avoir un effet pharmacologique (ou toxicologique). L'importance de la liaison aux protéines plasmatiques peut être déterminée in vitro ou ex vivo par dialyse à l'équilibre, ultrafiltration ou ultracentrifugation.

La répartition d'un article testé entre érythrocytes et plasma peut être déterminée in vitro ou ex vivo dans le sang animal et humain. La liaison aux protéines microsomales peut être évaluée par dialyse à l'équilibre. Les données décrivant la façon dont le médicament se lie aux protéines plasmatiques et comment fonctionne la répartition sang-plasma sont nécessaires pour faciliter l'évaluation des données pharmacologiques, pharmacocinétiques et toxicologiques. (Voir également SEND 3,1)

Considérations réglementaires concernant la fixation des protéines plasmatiques, la répartition entre sang et plasma et les études de fixation des protéines microsomales

L'étude de la fraction non liée aux protéines plasmatiques ou microsomales d'un article testé est essentielle pour caractériser le profil pharmacocinétique in vivo de la dose, de l'exposition, de l'efficacité et des marges de sécurité en pharmacologie clinique. L'évaluation chez plusieurs espèces des liaisons aux protéines plasmatiques est une exigence de l'IND détaillée dans le guide ICH M3(R2).

Méthodes

  • Méthode pour la liaison aux protéines plasmatiques

    • Système de test : pool plasmatique de chaque espèce ou solutions de protéines plasmatiques spécifiques (par exemple, albumine de sérum humain, α1-glycoprotéine acide, gamma-globuline)
    • Les concentrations sont choisies pour délimiter des expositions cliniques connues (0,1 - 10X Cmax), sauf si elles sont limitées par la solubilité

    Dialyse à l'équilibre

    La dialyse à l'équilibre est réalisée à l'aide d'un appareil de dialyse à haut débit (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Une matrice fortifiée (plasma ou protéine plasmatique isolée) est ajoutée à la chambre du donneur tandis que la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) est ajoutée à la chambre de réception de chaque puits. Les plaques sont ensuite scellées avec une membrane perméable aux gaz et incubées à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant le temps indiqué (voir ci-dessous). Après incubation, les échantillons de chaque chambre sont analysés par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).

    • Stabilité dans la matrice : l'article testé est incubé dans du plasma et de la DPBS à une concentration unique pouvant aller jusqu'à cinq points dans le temps
    • Temps à l'équilibre : l'article testé est ajouté au plasma à une concentration unique et dialysé contre le DPBS pendant un maximum de cinq points dans le temps.
    • Dépendance à la concentration de la liaison aux protéines : L'article testé est ajouté au plasma à trois concentrations et dialysé contre le DPBS pendant le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre.
    • Un témoin positif comme la warfarine est testé en parallèle en dialyse d'équilibre pendant 5 heures ou plus.

    Ultrafiltration

    Du plasma fortifié sera ajouté à la partie réservoir de l'échantillon d'un dispositif d'ultrafiltration avec un seuil de coupure au poids moléculaire de 30 000 Da. Les échantillons seront centrifugés à 37 °C et 2 000 × g pendant 15 minutes (ou toutes autres conditions appropriées). Après la centrifugation, l'ultrafiltrat sera analysé par LC-MS pour déterminer les concentrations de l'article testé par rapport aux concentrations initiales. Toutes les déterminations des liaisons protéiques seront réalisées en triple.

    • Liaison non spécifique : l'article testé est ajouté pour contrôler l'ultrafiltrat de plasma (PUF) à deux concentrations et centrifugé selon la procédure d'ultrafiltration. Le dialysat sera analysé pour déterminer la récupération de l'article testé et la possibilité de liaison non spécifique en l'absence de plasma.
    • Dépendance à la concentration de la liaison aux protéines : l'article testé est ajouté au plasma à cinq concentrations et centrifugé selon la procédure d'ultrafiltration. L'ultrafiltrat sera analysé à la recherche de l'article testé.

    Ultracentrifugation

    Du plasma fortifié sera ajouté aux tubes d'ultracentrifugeuse et centrifugé à 37 ºC à 223 000 × g pendant 4 heures (ou d'autres conditions appropriées) pour obtenir la séparation de l'ultracentrifugat du plasma des protéines plasmatiques. Après centrifugation, l'ultracentrifugé sera analysé par LC-MS et comparé aux concentrations initiales.

    • Liaison non spécifique : l'article test est ajouté pour contrôler le plasma humain et l'ultrafiltrat de plasma (PUF) à deux concentrations et incubé dans des tubes d'ultracentrifugation pendant 4 heures. La matrice sera analysée pour déterminer la récupération de l'article testé et la liaison potentielle non spécifique en l'absence de plasma.
    • Dépendance de la liaison protéique à la concentration : l'article test est ajouté au plasma à cinq concentrations et centrifugé selon le procédé d'ultracentrifugation. L'ultracentrifugé sera analysé à la recherche de l'article testé.
  • Méthode de partition sang-plasma

    Les études de partition sang-plasma permettent de déterminer la répartition in vitro entre sang et plasma de l'article testé dans le sang de différentes espèces, dont l'être humain.

    • Système de test : du sang de chaque espèce animale peut être regroupé, d'au moins trois donneurs. Le sang humain obtenu d'au moins trois volontaires ne sera pas mélangé.
    • Les taux d'hématocrite sont déterminés pour les échantillons de sang animal regroupés et les échantillons de sang humain individuels.
    • Le sang est stocké à 2-8 °C et utilisé aussi vite que possible dans les 1 semaines à compter de sa réception.

    L'article testé est ajouté au sang et les aliquots initiaux sont prélevés. Le sang fortifié est incubé à 37 °C comme indiqué. Après l'incubation, les aliquots sont prélevés pour analyses. Le sang restant est centrifugé pour obtenir du plasma ; des aliquots sont prélevés pour être analysés et comparés aux aliquots initiaux.

    • Stabilité dans la matrice : l'article testé est incubé dans du sang à une concentration unique pendant jusqu'à quatre points dans le temps.
    • Temps à l'équilibre : l'article testé est ajouté au sang à une concentration unique pendant jusqu'à quatre points dans le temps.
    • Dépendance à la concentration de la liaison protéique : l'article à tester est ajouté au sang à 5 concentrations maximum et incubé jusqu'au point d'équilibre.

    Pour les articles testés radiomarqués, les aliquots du sang sont solubilisés avant le comptage par scintillation liquide (CSL). Pour les articles testés non radiomarqués, les aliquots de sang sont lysés avant l'extraction et l'analyse par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).

  • Méthode pour la liaison aux protéines microsomales

    Une évaluation du potentiel de liaison d'un article testé à la protéine microsomale du foie humain in vitro permet de corriger la fraction non liée dans les dosages utilisant ces systèmes.

    La dialyse d'équilibre est effectuée en trois exemplaires à l'aide d'un appareil de dialyse à haut débit (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT). Des microsomes fortifiés sont ajoutés à la chambre du donneur tandis qu'une solution tampon est ajoutée à la chambre du récepteur de chaque puits. Les plaques sont ensuite scellées avec une membrane perméable aux gaz et incubées à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 5 heures. Après incubation, les échantillons de chaque chambre sont analysés par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).

    • Liaison protéique : les microsomes de foie humain sont dilués à trois concentrations (0.05, 0.1, 0,5 mg/mL) dans une solution tampon de phosphate. L'article testé est ensuite ajouté aux microsomes à trois concentrations pour un total de 9 échantillons. Les échantillons de matrice fortifiée sont transférés en trois exemplaires dans des chambres de donneur HTD et dialysés contre le phosphate pendant 5 heures.
    • Stabilité dans les microsomes : les échantillons de matrice fortifiée ci-dessus sont incubés à 37 °C dans 5 % de CO2 pendant 0 et 5 heures.

Livrables

Les tests de liaison aux protéines plasmatiques permettront d'identifier le degré de liaison de l'article testé, en fournissant un pourcentage lié et non lié, le temps nécessaire à l'équilibre de la dialyse, et le profil de dépendance à la concentration chez l'homme et d'autres espèces précliniques sélectionnées. La répartition entre sang et plasma fournira un coefficient de partition. Ces données peuvent ensuite être utilisées pour calculer la fraction libre dans le plasma afin de permettre la correction des expositions in vivo en fonction des marges d'efficacité et de sécurité du profil.

Les dosages de liaison aux protéines microsomales permettront d'identifier l'étendue de la liaison de l'article testé aux protéines microsomales du foie humain pour la correction de la CI50 ou d'autres paramètres pour tenir compte de la fraction libre du médicament.

Contactez-nous

Nous contacter